PCR, qPcr işlemleri ve Gıda Alerjenleri

 

PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)

DNA ve RNA üzerinden belirlenmiş, bir veya birden fazla bölgenin saflaştırılarak elde edilmiş olan Taq polimeraz enzimleri ve kimyasal olarak üretilmiş olan oligonükleotid primerler kullanılarak bir otomatik sistem vasıtasıyla in vitro şartlarda çoğaltılması yöntemidir (Temizkan, 1999). Bu yöntemle amacımız dizilimi belirlenmiş iki bölge arasında bulunan bir DNA parçasını çoğaltmaktır. Bir DNA polimeraz tarafından katalizlenen bir seri sentetik tepkimenin primerleri olarak iki oligonükleotid tipik olarak farklı dizilere sahiptir (Devrim, Kaya, 2004).

PCR’ın Aşamaları 

PCR işleminde 3 aşama uygulanmaktadır. Bunlar;

1. Denatürasyon; Çift zincirli olan DNA moleküllerinin sıcaklık yardımı ile açılması işlemidir. G+C yönünden zengin dizilerde denatürasyon ısısı yükseltilebilir. Denatürasyonun tam gerçeklememiş olması durumunda verim düşük olur. DNA’nın uzun sürede yüksek sıcaklığa maruz kalması ise DNA polimeraz aktivitesini düşürmektedir (Şahin vd 2000).

Şekil 1.1 PCR çoğalmasının aşamaları (Vierstraeete, 1999)

     2. Annealing (Yapıştırma): Primer yapışması için ihtiyaç duyulan sıcaklık hesaplanırken, her bir A ve T için 4 °C alınır. Yapışma sıcaklığı 55-72 °C arasında değişmektedir. (Şahin, 2000). Primer yapışması için gerekli zamanın uzunluğu ve uygulanacak ısı, primerlerin baz içeriğine, uzunluğuna ve derişimine bağlıdır (Howe, 1989).

Şekil 2.2 PCR çoğalmasının aşamaları (Vierstraete, 1999).

     3. Zincirin Uzaması (Extension): Uzama zamanı hedef dizinin derişimine, uzunluğuna ve ayrıca ısıya bağlıdır. Optimum sıcaklık 72 °C’de 1 dakikadır. 1 dakikada 2kb’a kadar uzama sağlanabilir. Döngü sayısı, başta kalıp olarak kullanılan DNA konsantrasyonuna bağlıdır. Tek DNA ile başlandığı zaman en fazla 40 döngü, daha çok DNA ile başlandığı zaman ise ideal döngü sayısı 30 olmalıdır.

Şekil 3.3 PCR çoğalmasının aşamaları (Vierstraete, 1999).

PCR döngüsü denatürasyon aşaması, primerlerin bağlanması (annealing), ve elongasyon (extensiyon) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Peş peşe tekrar eden denatürasyon, bağlanma ve uzama aşamaları ile DNA fragmentleri üstel bir şekilde artmaktadır. Bu artışın sebebi, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde, diğer primer için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece bütün PCR döngüsü, DNA molekülü üzerinde hedef bölgenin iki katına çıkmasına neden olur. (Şahin vd 2000).

PCR’ın Çalışma Metodu

İlk aşamada çoğaltılacak hedef DNA izole edilir, deoksiribonükleotidler, tampon sıvı ve DNA polimeraz enzimi içeren ince duvarlı bir tüpün içine ilave edilir. Tüp PCR aleti içerisinde Denatürasyon, annealing ve elongasyon aşamalarından sonra çoğaltılmış olur ve karakterize edilir.

qPCR Metodu

Son yıllarda ün kazanmış bir yöntem olan qPCR teknolojisi, elde edilmiş DNA ve mRNA örneklerinin çoğaltımını ve bu ürünlerin miktarını bir tüpte tespit edebilen önemli tekniktir (Klein, 2002).Bu tekniğin esası PCR çoğaltımını gösterebilen ve monitörize edebilen floresan işaretli prob ve boyalar ile yapılan, floresanın oluşan DNA ile orantılı bir şekilde arttığı bir çoğaltma tekniği olmasıdır (Kubista., 2008). PCR ile arasında ki fark floresan işaretli prob ve boyalar sayesinde gerçek zamanlı olarak görülebilmektedir.

Nasıl gerçekleşir?

Hedef DNA izole edildikten sonra tüplere floresan boyası ilave edilir, floresan boyası DNA ile karıştıktan sonra tüpler ‘thermal cycler’ cihazında PCR işlemi gerçekleştirilir ve karakterizasyonu yapılır.

GIDA ALERJENLERİ

Gıda alerjenleri, gıda veya gıda bazlı maddelerin ağız yoluyla vücuda alınmasından sonra immünolojik mekanizmalar vasıtasıyla tetiklenen, vücutta kendini gösteren bekenmedik etkiler olarak tanımlanır (Arıcan, 2002; Köksel ve ark., 2011). Gıda alerjisi solunum sistemi, dolaşım sistemi veya ciltte farklı belirtiler ile meydana gelebilmekte, bazı durumlar da anaflaksi gibi ileri boyutlu ölümle sonuçlanabilen farklı klinik bulgular da görülebilmektedir. Bu sebeple gıdalarda bulunan alerjenler, insan sağlığını ve dolaylı yolla da gıda güvenliğini önemli boyutta tehdit altında bırakmaktadır. (Kınık, Yerlikaya, 2015).

Gıda Alerjenlerinin Oluşum Mekanizması

Gıda alımı sonucu ortaya çıkan beklenmedik reaksiyonlar, toksik ve toksik olmayan etkiler olarak sınıflandırılır. Toksik olmayan reaksiyonlar da kişisel duyarlılık ön plandadır. Toksik reaksiyonlar içinse bu etkiye sebep olan madde yeteri kadar tüketildiğinde herkeste görüldüğü için alınan miktar ile alakalı bir durumdur. Gıda alerjisi reaksiyonlarının sınıflandırılması şu şekilde yapılmıştır (Tayar vd 2011).

Gıda Alerjenlerinde Belirtiler

Gıda alerjilerine 4 tip aşırı duyarlılık reaksiyonu etkili olmaktadır. Bu reaksiyonların oluşturmuş olduğu klinik semptonlar;

Tip 1 reaksiyonları

-          Besine bağlı enterokolit

-          Solunum yolu: Larinks ödemi, Astma, rinokonjunktivit

-          Deri: Ürtiker, Anı ödem, atopik dermatit

-          Gastrointestinal: Gastrointestinalanaflaksi

-          İnfantil kolik

 Tip 2 reaksiyonları:

• Süt kaynaklı tronbositopenİ

Tip 3 reaksiyonları:

• Gıdaya bağlı enterokolit sendromu
• Gıdaya bağlı kolit sendromu
• Çölyak hastalığı
• Dermatitisherpetiformis
• Gıdaya bağlı malabsorbsiyon
• Heinersendromu
• İnek sütüne bağlı gastrointestinal kan kaybı
• Artrit

Tip 4 reaksiyonları:

• Çölyak hastalığı
• Gıdaya bağlı pulmonerhemosiderosis 

Mekanizması bilinmeyen reaksiyonlar:

• Migren ve epilepsi

 (Gıda alerjenlerinin organ ve sistemler üzerine etkisi (Bayrak, 2006; Yüksel, 2006).

Hangi Gıdalar Alerjiye Neden Oluyor?

Bilinen 160’dan fazla gıda alerji reaksiyonu mevcuttur. Sıkça alerjiye sebep olan gıdalar şunlardır; İnek sütü, yumurta, balık ve deniz ürünleri, kabuklu yemişler, tahıllar, etler, meyveler, sebzeler ve kuru baklagiller, soya fasulyesi, baharat ve çeşni vericiler, çikolata, bal, bazı içecekler ve katkı maddeleri.Bahsedilen gıdalar özellikler erken çocukluk döneminde alerjik reaksiyonlara sebep olmaktadır. Bazıları ise yaşam boyu devam edebilmektedir (Özdağlı, 2009).

Gıda alerjenlerinin tedavisi

Gıda alerjenlerine karşı tedavi ve korunma da en önemli etken erken teşhistir. Bireyler kendi vücutlarını ve vücutsal davranışlarını önceden teşhis etmiş olursa hastalığa yakalanma riski minimuma azaltılmış olur. Bireysel bazda ele aldığımız zaman çözüm bilinçli tüketimdir. Gıda güvenliği açısından bakıldığında, gıdaların muhafazası ve işlenmesi dönemlerinde gıdalara gösterilen hassasiyet artırılmalıdır. Alerjen maddelerin en önemli karakteristik özellikleri termal, kimyasal ya da enzimatik yapısına bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Gıdaların farklı formlarda bulunabilmektedir. Bu sebeple gıdaların depolama süreleri ve duyusal özelliklerinin geliştirilmesi, modifiye edilmesi tüketici açısından uygun bir üretimin gerçekleştirilmesi ve ek gıda ürünlerine çeşitliliğin sağlanabilmesi için gıdalar birçok işleme tabii tutulmaktadır (Özcan, Delikanlı, Yıldız, 2015).

Isıl işlem uygulamaları ısıya hassas proteinlerin alerjik reaksiyonların azaltılmasında, ısıl işlem olmayan teknolojiler alerjenitenin azaltılmasında ve besin değeri, renk, lezzet ve aroma gibi gıdanın doğal özelliklerinin muhafaza edilebilmesi açısından önemlidir (Kınık, Yerlikaya, 2015).

Kaynaklar

Klein, D., 2002. Quantification using real-time PCR technology: Applications and limitations. Trends Mol. Med., 8: 257–260.

 Kubista., 2008. M. Emerging real-time PCR applications. Drug Discovery Word summer, 57-66.

 Bayrak, P. 2006. Besin alerjileri. Sağlıkta Birikim, 1: 111-121.

 Öztürk, M., Besler, T., 2008. Besin Alerjileri (1. Baskı). Sağlık Bakanlığı, No:727, Ankara.

 Paykoç, E., 2017. Gıda Alerjisi, Gıda Alerjisinin Mekanizması, Tanı Yöntemleri ve Alerjenitenin Azaltılmasında Kullanılan Teknikler. Avrasya Üniversitesi. Lisans           Tezi. 34 sayfa.

 Kınık, Ö., Yerlikaya, O., 2015. Harbiye Askeri Müze ve Kültür Sitesi-İstanbul. 5.Gıda Güvenliği Kongresi. (7-8 Mayıs 2015, İstanbul).

 Erlich, H. A., Gelfand, D., SNINSKY, J., 1991. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science, 252: 1643-1651.

 Günel, T., Aydınlı, K., 2009. “Real-Time PCR” ve Uygulama Alanları. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi, 2(2):43-45.

Karakılıç, M., Suna, S., Tamer, C. E., Çopur, Ö. U., 2014. Gıda Alerjisi Reaksiyonları. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi 28(1):73-82